Ngày 19 tháng 8 năm 1864, Huỳnh Công Tấn phản bội dẫn đường cho quân Pháp bất ngờ bao vây đánh úp. Bản doanh Đám lá tối trời[7] thất thủ, Trương Định bị trọng thương (gãy xương sống)[8].

Về cái chết của ông, các nguồn không thống nhất về việc ông có tuẫn tiết hay không. Hầu hết các nguồn cho rằng ông đã tuẫn tiết để khỏi rơi vào tay giặc.[9][10][11][12] Mặt khác, theo Việt sử Tân Biên của Phạm Văn Sơn, "ông và 28 người tùy thuộc bị bắn chết"[13]. Khi ấy, ông 44 tuổi.

Hay tin Trương Định tuẫn tiết vua Tự Đức sai truy tặng ông phẩm hàm, và năm 1871 lại cho lập đền thờ ông tại Tư Cung (Quảng Ngãi). Con ông là Trương Quyền đã rút lên vùng Châu Đốc tiếp tục chống Pháp thêm 6 năm nữa.

Nhà thơ Nguyễn Đình Chiểu đã làm 12 bài thơ và một bài văn tế điếu ông. Trích giới thiệu một bài:


Bàn thờ Trương Định ở bên trong đền
Trong Nam, tên họ nổi như cồn
Mấy trận Gò Công nức tiếng đồn
Đấu đạn hỡi rêm tàu bạch quỷ
Hơi gươm thêm rạng vẻ huỳnh môn
Ngọn cờ ứng nghĩa trời chưa bẻ
Quả ấn Bình Tây đất vội chôn
Nỡ khiến anh hùng rơi giọt luỵ
Lâm dâm ba chữ điếu linh hồn.