Năm 1932, ông học tại trường Y-Dược, một thành viên của Đại học Đông Dương, đóng tại Hà Nội với suy nghĩ đây là nghề “tự do”, không phụ thuộc vào quan lại hay chính quyền thực dân. Ngày ấy, cả Đông Dương chỉ có một trường thuốc duy nhất tại Hà Nội mà người bản xứ không được dự các kỳ thi nội trú. Từ năm 1935, Tôn Thất Tùng được tuyển cùng 10 sinh viên khác làm ngoại trú tại Bệnh viện Phủ Doãn. Anh sinh viên y khoa Tôn Thất Tùng là người đầu tiên đấu tranh buộc chính quyền thực dân phải tổ chức thi nội trú cho các bệnh viện Hà Nội. Năm 1935, anh là người duy nhất được nhận vào làm việc tại khoa ngoại của trường Y-Dược, tức là bệnh viện Việt - Đức hiện nay.

Trong điều kiện học tập khó khăn, các thầy giáo Pháp chủ yếu chú trọng kiến thức sách vở, ít liên hệ tới điều kiện khí hậu và con người bản xứ, trang thiết bị thiếu, lỗi thời, bác sĩ Tôn Thất Tùng đã phải tự đặt ra cho bản thân những nguyên tắc học tập và làm việc, coi công việc thực tiễn hàng ngày là quan trọng bậc nhất và là nguồn động lực đi vào con đường nghiên cứu khoa học.

Qua học tập, trao đổi với các đồng nghiệp, đặc biệt là khả năng quan sát, suy luận, bác sĩ Tôn Thất Tùng đã phát hiện trong gan của một người bệnh có hàng chục con giun chui ở các đường mật. Với một dụng cụ thô sơ, chỉ bằng một con dao nạo, ông đã phẫu tích kỹ lưỡng cơ cấu của lá gan. Bằng phương pháp này, trong suốt thời gian từ 1935 đến năm 1939, ông đã phẫu tích trên 200 lá gan của các tử thi để nghiên cứu các mạch máu. Rồi ông vẽ lại thành các sơ đồ, đối chiếu chúng với nhau để tìm ra những nét chung. Trên cơ sở đó, ông đã viết và bảo vệ thành công luận án tốt nghiệp bác sĩ y khoa với nhan đề “Cách phân chia mạch máu của gan”. Với bản luận án này, ông đã được tặng Huy chương Bạc của Trường Đại học Tổng hợp Paris (Trường Đại học Y-Dược tại Hà Nội lúc bấy giờ là một bộ phận). Bản luận án được đánh giá rất cao và trở thành tiền đề cho những công trình khoa học nổi tiếng của ông. Sau này, chính vì biết rõ các cơ mạch trong gan, vào những năm 1960, ông đã nghiên cứu thành công phương pháp “cắt gan có kế hoạch”. Đây là một phương pháp hoàn toàn mới và hiện đại, khác hẳn với những phương pháp trước đây. Vì trước đó, do chưa có mô tả chính xác các mạch máu trong gan nên người ta vẫn quen dùng phương pháp “cắt gan không có kế hoạch”. Ông cho rằng làm như vậy thì thật nguy hiểm, vì cắt xong nếu không đúng mạch, bệnh nhân có thể chết do chảy máu hoặc do hoại tử gan. Để ghi nhận công lao của người đầu tiên đã tìm ra phương pháp cắt gan này, người ta gọi là “Phương pháp mổ gan khô” hay “Phương pháp Tôn Thất Tùng”. Chính vì thế, giáo sư người Pháp nổi tiếng Malêghi trong báo “Lion phẫu thuật”, năm 1964 đã viết: “Trường Đại học Y khoa Hà Nội có thể tự hào đã có hai thành tựu trong lịch sử của mình, một là đã nghiên cứu lần đầu tiên về cơ cấu các mạch trong gan, hai là lần đầu tiên đã thành công trong việc cắt gan có kế hoạch”.

Cách mạng tháng Tám thành công, Tôn Thất Tùng là một trong những trí thức đầu tiên mang hết nhiệt tình xây dựng Trường Đại học Y khoa của nước Việt Nam DCCH.

Cuộc kháng chiến chống thực dân Pháp bùng nổ, ông đã hăng hái đi theo tiếng gọi của Tổ quốc, của Chủ tịch Hồ Chí Minh. Cùng giáo sư, bác sĩ Hồ Đắc Di, ông đã góp nhiều công sức vào việc di chuyển và xây dựng Trường Đại học Y khoa qua nhiều địa điểm, là một trong những người chủ chốt đầu tiên đào tạo đội ngũ thầy thuốc, nghiên cứu khoa học và tổ chức lực lượng phục vụ kháng chiến. Cùng với giáo sư Đặng Văn Ngữ, ông đã góp phần vào việc nghiên cứu, sản xuất Penicilline phụ vụ thương bệnh binh. Năm 1947, ông được Chính phủ cử giữ chức Thứ trưởng Bộ Y tế. Suốt thời kỳ chống Mỹ cứu nước, ông đã cùng tập thể bác sĩ và nhân viên bệnh viện Việt - Đức tham gia cấp cứu cho thương bệnh binh.

Từ sau ngày hòa bình lập lại, để tập trung khả năng vào công tác khoa học - kỹ thuật, ông được cử làm Giám đốc bệnh viện hữu nghị Việt - Đức, chủ nhiệm bộ môn Ngoại trường Đại học Y khoa Hà Nội. Với tất cả tâm huyết của mình, giáo sư Tôn Thất Tùng đã cống hiến rất nhiều cho sự nghiệp đào tạo các thầy thuốc và chuyên gia giỏi về y học, cho việc xây dựng ngành phẫu thuật Việt Nam, cho công tác nghiên cứu  và phát triển ngành y học của nước ta.

Năm 1958, giáo sư tiến hành thành công ca mổ tim đầu tiên ở Việt Nam.

Năm 1959, giáo sư phát triển khoa mổ sọ não và khoa ngoại nhi.

Năm 1960, giáo sư là người đầu tiên đề xuất và áp dụng có kết quả xuất sắc việc mổ gan bằng phương pháp Việt Nam.

Năm 1965, giáo sư triển khai thành công việc mổ tim bằng máy tim phổi nhân tạo ở nước ta.

Giáo sư đã tham gia nhiều hội nghị khoa học quốc tế, được mời giảng bài ở nhiều trường đại học y khoa, được bầu làm viện sĩ Viện Hàn lâm Y học Liên Xô, Hội quốc gia những nhà phẫu thuật Cộng hòa Dân chủ Đức, Viện Hàn lâm Phẫu thuật Paris và Hội những nhà phẫu thuật Lion (Pháp), Hội quốc gia những nhà phẫu thuật Angiêri. Năm 1977, giáo sư được Viện Hàn lâm Phẫu thuật Paris tặng Huy chương phẫu thuật quốc tế mang tên Lannelongue. Đây là phần thưởng cao quý dành cho những nhà phẫu thuật xuất sắc thế giới được trao định kỳ 5 năm một lần. Ông vinh dự và xứng đáng là một trong 12 người trên thế giới và là người duy nhất ở Việt Nam được tặng huy chương ấy.