Cấu tạo của ruột non giống như cấu tạo chung của thành ống tiêu hóa gồm 4 lớp: màng bọc, lớp cơ, lớp dưới niêm mạc và lớp niêm mạc.

• Màng bọc: màng bọc của tá tràng cố định là phúc mạc ở mặt trước và mô liên kết ở mặt sau . Phúc mạc của hỗng tràng- hồi tràng được kết nối với phúc mạc thành bụng qua một nếp phúc mạc gọi là mạc treo ruột non. Phúc mạc gồm hai lớp là lớp thanh mạc và tấm dưới thanh mạc.
• Lớp cơ gồm hai lớp cơ trơn. Các sợi cơ của lớp ngoài xếp theo chiều dọc (lớp cơ dọc), các sợi cơ của lớp trong còng quanh thành ống tiêu hóa (lớp cơ vòng). Giữa hai lớp có các mạch máu, mạch bạch huyết và một đám rối thần kinh tự chủ chi phối cho cơ trơn. Lớp cơ tạo các nhu động ruột đẩy các thành phần trong hệ tiêu hóa về phía trước, nhào trộn thức ăn với dịch tiêu hóa. Tại một số điểm trên đường đi, lớp cơ vòng dày lên tạo nên các cơ thắt. Cơ thắt có vai trò làm chậm sự dịch chuyển về phía trước của các thành phần bên trong ống tiêu hóa, giúp cho sự tiêu hóa và hấp thu có thời gian diễn ra.
• Lớp dưới niêm mạc: là lớp mô liên kết lỏng lẻo chứa các đám rối mạch máu và thần kinh, các mạch bạch huyết và các mô dạng bạch huyết với số lượng khác nhau tùy từng loại. Các mạch máu bao gồm các tiểu động mạch, các mao mạch, các tiểu tĩnh mạch. Đám rối thần kinh trong lớp này là đám rối dưới niêm mạc, có vai trò chi phối cho niêm mạc.
• Lớp niêm mạc có chức năng bảo vệ, tiết dịch và hấp thu. Ở ruột non, niêm mạc là lớp tế bào thượng mô trụ xen kẽ với tế bào tiết nhầy. Ở dưới bề mặt của thượng mô trụ có những tuyến đổ dịch tiêu hóa vào lòng ống tiêu hóa.