Không chấp nhận chính quyền của họ Mạc, một số quan lại cũ của nhà Lê, đứng đầu là Nguyễn Kim, đã họp quân, nêu danh nghĩa “phù Lê diệt Mạc”, nổi dậy ở vùng Thanh Hoá. Một nhà nước mới được thành lập ở đây, sử cũ gọi là Nam triều để phân biệt với Bắc triều của nhà Mạc. Chiến tranh Nam - Bắc triều bùng nổ, kéo dài cho đến cuối thế kỉ XVI. Triều Mạc bị lật đổ. Đất nước bước đầu được thống nhất lại. Nhưng không lâu sau, hình thành một thế lực căn cứ ở mạn Nam — thế lực phong kiến họ Nguyễn.

Năm 1545, Nguyễn Kim chết, con rể là Trịnh Kiểm được cử lên thay, nắm toàn bộ binh quyền. Người con thứ của Nguyễn Kim là Nguyễn Hoàng xin được vào trấn thủ đất Thuận Hoá. Đất Thuận Hoá trở thành nơi dấy nghiệp của họ Nguyễn.

Năm 1627, cuộc chiến tranh Trịnh - Nguyễn bùng nổ, kéo dài đến cuối năm 1672. Không phân được thắng bại, hai bên giảng hoà, lấy sông Gianh (Quảng Bình) làm giới tuyến, chia đất nước làm hai : Đàng Ngoài và Đàng Trong, với hai chính quyền riêng biệt.