Khi quân Pháp tấn công Đà Nẵng kéo quân vào đánh Bến Nghé, Gia Định tháng 02 năm 1859. Trương Định mang cơ binh đồn điền của mình gia nhập quân đội triều đình chống giặc. Thành Gia Định thất thủ, Trương Định đem quân đóng ở Thuận Kiều (Chợ Lớn), ông thường đi tiên phong trong các trận đánh, lập nhiều chiến công như phục kích giết tên Đại úy Barbe của Pháp ngày 07 tháng 12 năm 1860.

Đầu năm 1861sau trận thua ở Phú Thọ-Sài Gòn, Trương Định lui quân về Gò Công, tích trữ lương thực, rèn đúc vũ khí và chiêu mộ nghĩa quân. Trương Định đã chọn giồng Sơn Quy làm điểm đóng quân, cách trung tâm huyện lỵ Tân Hòa 2 km về phía tây bắc thuộc làng Tân Niên Đông, nay thuộc xã Long Hưng thị xã Gò Công. Khi hay tin Trần Xuân Hòa[3] (phủ cậu) bị Pháp xử tử ngày 10 tháng 01 năm 1862, Trương Định mang quân từ Gò Công vây đánh đồn Gia Thạnh, ngày hôm sau đem 10 chiến thuyền đánh đồn Rạch Gầm. Từ ngày 28 tháng 02 đến ngày 06 tháng 3 năm 1862, nghĩa quân Trương Định hoạt động mạnh vùng Chợ Cũ-Mỹ Tho.

Đầu năm 1862 trận nổi bật của nghĩa quân Trương Định là trận tấn công Chợ Lớn đêm 06 tháng 4 năm 1862 thiêu hủy nhiều cơ sở trong đó có kho đạn của địch. Việc nghĩa quân dũng cảm, táo bạo tiến công một cơ sở hậu cần và kho vũ khí trên vùng kiểm soát rộng lớn của giặc làm cho nhân dân thêm tin tưởng, còn binh lính giặc thì hoang mang. Đánh giá hậu quả của trận Chợ Lớn, tác giả Schreiner đã viết “Trong vụ này, tài vật không hư hao bao nhiêu. Nhưng nghiêm trọng ở chỗ gây hoang mang cho mọi người. Chúng ta nắm quyền lực trong một vùng rộng lớn mà bị đe dọa ngay tại nơi trung tâm[4]”. Với những chiến công liên tiếp mà nghĩa quân đã đạt được, Trương Định được thăng chức Phó Lãnh binh Gia Định.

Tháng 3 năm 1862, giặc pháp tấn công chiếm thành Vĩnh Long, vua Tự Đức hoảng sợ từ chủ chiến chuyển sang chủ hòa, cử Phan Thanh Giản và Lâm Duy Hiệp vào Gia Định ký hiệp ước Nhâm Tuất ngày 05 tháng 6 năm 1862 cắt ba tỉnh miền Đông Nam kỳ (Biên Hòa, Gia Định, Định Tường) cho Pháp đổi lấy thành Vĩnh Long. Triều đình ra lệnh cho Trương Định bãi binh, phong là lãnh binh An Hà, buộc phải bãi binh ở Tân Hòa và gấp rút nhận chức mới ở An Giang nhưng lòng dân và nghĩa quân không chịu.