Pepsin hoạt động ổn định nhất trong môi trường axit giữa 37 °C và 42 °C. Theo đó, hoạt điểm chính được tổng hợp và hoạt động trong dạ dày (pH 1.5 to 2). Pepsin sẽ tiêu hóa lên đến 20% nhóm amide bằng cách tách ưu tiên N-terminal của các amino acid thơm như phenylalanine, tryptophan và tyrosine.Pepsin thể hiện sự phân cắt ưu tiên đối với chất kỵ nước, vòng thơm, ở những vị trí P1 và P1'. Tăng nhạy cảm quá trình thủy phân nếu có một amino acid chứa lưu huỳnh gần với bó peptide, trong đó có một loại amino acid thơm. Phân cắt pepsin Phe1Val, Gln4His, Glu13Ala, Ala14Leu, Leu15Tyr, Tyr16Leu, Gly23Phe, Phe24. Pepsin hoạt động tối đa ở pH 2.0 và không hoạt động ở pH 6.5 và trở lên, tuy nhiên pepsin là không hoàn toàn biến tính hoặc không thể phục hồi bất hoạt cho đến khi pH 8,0.Do đó, pepsin trong dung dịch lên đến pH 8,0 có thể được kích hoạt lại khi tái axit hóa. Sự ổn định của pepsin ở pH cao có ý nghĩa quan trọng về bệnh trào ngược hầu thanh quản. Pepsin vẫn ở thanh quản sau sự kiện trào ngược dạ dày. PH trung bình của vùng hầu thanh quản (pH = 6,8) pepsin sẽ không hoạt động nhưng có thể được kích hoạt lại sau khi các sự kiện axit trào ngược sau đó gây thiệt hại cho các mô xung quanh.