Enzyme chỉ có thể hoạt động trong những điều kiện nhất định. Hầu hết các enzym trong cơ thể hoạt động tốt nhất ở khoảng 37°C. Ở nhiệt độ thấp hơn, chúng vẫn hoạt động nhưng chậm hơn nhiều. Tương tự, các enzym chỉ có thể hoạt động trong một khoảng pH nhất định phụ thuộc vị trí của chúng trong cơ thể. Ví dụ, các enzym trong ruột hoạt động tốt nhất ở độ pH 7,5, trong khi các enzym trong dạ dày hoạt động tốt nhất ở độ pH 2 vì dạ dày có tính axit hơn nhiều.

Nếu nhiệt độ quá cao / môi trường quá axit / môi trường quá kiềm, enzyme sẽ thay đổi hình dạng gây khó khăn trong việc liên kết với cơ chất.